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不經(jīng)顯微操作進行體細胞克隆(徒手克隆)
日期：2025-05-01 14:53
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摘要：
本文描述了一種手工平分無透明帶卵母細胞的改進核移植方法，Hoechst染色挑選胞質(zhì)體，以培養(yǎng)的原代顆粒細胞為體細胞與2個胞質(zhì)體進行2次細胞融合。檢測微滴、穴中穴(WOW)和微管(GO)3個系統(tǒng)培養(yǎng)的無透明帶胚胎，胚泡率分別為0，18和36 ，方法簡單、快速、經(jīng)濟，有可能取代現(xiàn)有的體細胞核移植技術(shù)而大量應(yīng)用。
影響反芻動物體細胞核移植廣泛應(yīng)用的主要技術(shù)障礙是：① 體外法效率低；②妊娠和產(chǎn)犢率低，出生后死亡及異常發(fā)育率高；③體外法所需實驗室設(shè)備費用高，技術(shù)難度大。顯微操作被認為是該工作中不可缺少的。此外，工具制作設(shè)備如研磨機，微鍛爐等的使用均需較高技術(shù)水平。這些要求相當程
度地限制了核移植技術(shù)的簡化及廣泛應(yīng)用。
Peura等(1998)建立了一種不經(jīng)顯微操作進行牛胚胎細胞克隆的方法，用20~60細胞階段的卵裂球胚胎為供體。
用1016個卵母細胞進行了7次重復(fù)核移植試驗，其主要步驟的平均效率和大概需要的時間見表1。棄去**極體不明顯的卵母細胞(占28%)。這些丟棄的細胞不能用于核移植，因此，沒有將其列入效率統(tǒng)計。在該過程完成后5rain觀察到丟棄細胞在均分期間發(fā)生分解。*終胞質(zhì)體選擇的準確度接近100％，盡管有9%的差別，這主要是因技術(shù)失誤及細胞估計數(shù)和實際獲得細胞數(shù)量間的差異而引起。細胞的丟棄幾乎都是在融合時因分解或技術(shù)失誤而引起。融合失敗(融合后15~20rain分離細胞對)的細胞對異常且在重復(fù)融合中通常被消除。
每個試驗平均用了105個卵母細胞并形成35個胞質(zhì)體一胞質(zhì)體一顆粒細胞3聯(lián)體。每次試驗時間不超過3h。分別在3個培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，其胚胎發(fā)育率見表2。除培養(yǎng)在微滴與WOW培養(yǎng)系統(tǒng)中胚胎卵裂率(2個或2個以上細胞)外，其余數(shù)值都差異顯著。一般來說，微滴中培養(yǎng)的胚胎沒有超過8~16細胞階段；僅在WOW或GO系統(tǒng)中能發(fā)育到致密期。通常在胚胎重組后第6 d開始形成胚泡，到第7d結(jié)束。因滋養(yǎng)層細胞將30％左右的胚胎粘在培養(yǎng)皿表面，因此在wOw系統(tǒng)中移去胚泡有些困難。但GO系統(tǒng)可避免這些問題。
不需顯微操作體細胞核移植的利益和前景遠大。當前的成果包括降低裝備費用，簡化預(yù)備工作及實驗技術(shù)要求低。任何做過胚胎方面試驗和口吸管方面工作的人都能很快掌握。盡管用卵母細胞試驗的直接工作沒有顯著減少，但降低了這些工作的技術(shù)難度。此外，與早期的技術(shù)相比，預(yù)備工作如制作工具可以省略。然而，應(yīng)該注意到產(chǎn)生三倍體需要較多的卵母細胞。無透明帶的胚胎可能有利于嵌合體的制作，克隆方法的簡化也將有利于核移植的自動化。在卵母細胞成熟期間，用于建立該方法的供
體細胞是貼壁的原代培養(yǎng)的顆粒細胞，這些細胞并不是都很適合做供體。隨著方法的進一步改進，可能能用不同器官組織的傳代細胞和血清饑餓培養(yǎng)的細胞。
總之，這種新穎、簡單的體細胞核移植方法的出現(xiàn)，將大大降低目前核移植對昂貴且操作技術(shù)難度大的顯微操作儀的依賴。本文報道的初步試驗結(jié)果表明，該方法在體細胞克隆技術(shù)方面的發(fā)展具有相當大的潛力，滿足農(nóng)業(yè)領(lǐng)域內(nèi)克隆技術(shù)廣泛應(yīng)用的需要。上述方法的可行性需要通過這些移植胚胎妊娠(目前正在獲取)和產(chǎn)出健康后代的數(shù)據(jù)來證實。)摘自《國外畜牧科技》
